Escherichia coli : organisme modèle de laboratoire

Escherichia coli : au cœur de la matriX !

Fun fact :
Le chromosome d’Escherichia coli contient l’équivalent de 1,2 octet de données. Tu as donc l’équivalent de 60 téraoctets (To) de données dans ton intestin.
Personnes contact :
Catherine Turlan, ingénieure de recherche : Catherine.Turlan@univ-tlse3.fr Service SIG : https://cbi-toulouse.fr/fr/equipe-service-ingenierie-genetique

Photo originale

Photo originale (à gauche)

Photo modifiée

Photo modifiée (à droite)

Séquençage d’ADN utilisant la méthode SANGER (« chain-Termination DNA Sequencing ») après électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant et exposition sur film d’autoradiographie. A partir d’un oligonucléotide radio-marqué (32P) complémentaire de la séquence d’un brin de l’ADN d’un gène d’intérêt (cloné dans un plasmide), on synthétise progressivement une copie de ce brin grâce à une ADN polymérase, en présence d’un mélange de chacun des 4 nucléotides composant l’ADN : Adénosine (A), Cytosine (C), Guanosine (G) et Thymidine (T). 4 réactions de polymérisation différentes sont réalisées en ajoutant dans chacune un analogue (semblable) de ces bases (les di-desoxynucléotides ddA ou ddC ou ddG ou ddT) qui stoppent la réaction de synthèse d’ADN une fois incorporés. Cet ajout génère des brins d’ADN radio-marqués de longueur différentes, terminés soit par ddA ou ddC ou ddG ou ddT, qui seront ensuite séparés en fonction de leur taille après migration sur un gel d’électrophorèse dénaturant (Urée + haute température). L’exposition du gel sur un film d’autoradiographie, sensible au rayonnement radioactif, va permettre de révéler tous les fragments synthétisés dans chacune des 4 réactions de terminaison, comme une échelle permettant la lecture de la séquence d’ADN.

Crédits photos : ©Violette Morales

Escherichia coli

Famille : Enterobacteriaceae

Forme : bâtonnet

Type : Gram négatif

Découverte : en 1885, par Theodor Escherich

Adresse : tube digestif

Spécificité : bactérie commensale dont la plupart des souches sont inoffensives, celles produisant des shigatoxines sont pathogènes.

Pathologies : gastroentérite, infection urinaire, méningite ou sepsis

Explications

Tout microorganisme, aussi minimaliste soit-il, met en œuvre de multiples et complexes processus biologiques pour assurer sa survie, sa multiplication, mais aussi son adaptation aux conditions environnementales. Ces processus dépendent des protéines codées par le génome, le chromosome et éventuellement les plasmides, qui constitue le patrimoine génétique de chaque souche bactérienne.

Afin de caractériser la fonction de chaque protéine et de comprendre dans quel processus biologique elle est impliquée (ex : virulence, compétence, voie métabolique), un large éventail de méthodologies d’ingénierie génétique, de la génétique classique (à partir d’un phénotype mutant donné, identification du ou des gènes responsables) à la génétique inverse (comprendre la fonction de gènes d’intérêt par l’observation des mutants correspondants), peuvent être mises en œuvre.

La modification « à façon » de chaque génome et/ou de son expression permet d’accéder aux mécanismes physiologiques intracellulaires, intercellulaires, et d’interaction avec les cellules hôtes dans le cas des bactéries pathogènes.
L’ingénierie génétique microbienne est à l’origine de l’avènement de la biologie de synthèse qui s’attache à concevoir et à construire de nouveaux systèmes ou de nouvelles fonctions biologiques dans les bactéries. Elle est particulièrement développée dans le cadre de l’ingénierie métabolique qui utilise les techniques de génétique moléculaire pour reprogrammer les réseaux métaboliques d’une cellule vivante, dans le but de lui faire produire une substance d’intérêt (par exemple l’hormone de croissance) ou de l’ingénierie de bioremédiation qui permet d’améliorer les capacités de décontamination de certaines bactéries (voir panneau Titans).

Enfin, la « chirurgie génomique » est cruciale pour la compréhension des mécanismes de virulence et d’acquisition de résistances multiples aux antibiotiques, problématiques de santé majeures à ce jour.

Développement de deux types d’ingénierie de génétique bactérienne :

1 – Modification du patrimoine génétique par méthodologie de génie génétique

Les protéines synthétisées seront modifiées :
✓ en délétant (enlevant) ou insérant des gènes
✓ en modifiant spécifiquement les gènes d’intérêt (mutation, échange allélique)
✓ de façon permanente et héréditaire

Illustration des différentes modifications possible du génome
2 – Modification de l’expression génique.

Ces modifications caractérisées d’ « épigénétique », permettent de comprendre les mécanismes modifiant de manière réversible, transmissible et adaptative l’expression des gènes sans en changer la séquence nucléotidique.
La quantité de chaque protéine est modulée :
✓ négativement (répression) ou positivement (activation)
✓ de façon inductible ou réversible
✓ en régulant la transcription du gène correspondant

Illustration des différentes modifications de l’expression de gènes possible

Ce type de méthodologies permet d’étudier le phénotype (traits observables) associé aux modifications réalisées sur le ou les gènes d’intérêt. Il permet également de créer des souches (lignées) bactériennes présentant de nouvelles caractéristiques ou propriétés.

Développement de technologies dérivées des systèmes CRISPR-Cas
Il s’agit d’un système initialement caractérisé comme un système d’« immunité » des bactéries contre les phages ou les plasmides invasifs, qui a été « domestiqué » et est utilisé en tant qu’outil d’ingénierie génétique chez tous les organismes (bactéries, archées, eucaryotes).

Cette découverte des « ciseaux moléculaires » CRISPR-Cas9, a été récompensée du prix Nobel de chimie 2020 attribué à Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna.

Il s’agit d’un outil :
✓ simple car il implique une seule protéine, la protéine Cas, et un ARN guide (gRNA)
✓ précis car il permet de cibler au nucléotide près
✓ universel car possibilité de ciblage de n’importe quelle séquence de 20 nts

Illustration des différentes modifications de l’expression de gènes possible

Au LMGM-CBI, un service d’ingénierie génétique conseille et offre ses services au équipes de recherche de l’unité, de l’institut ou aux équipes extérieures.